提高赤藓糖醇产量的新策略：通过在固态发酵中加入生物炭形成“微区”
Title: Novel strategy of incorporating biochar in solid-state fermentation for enhancing erythritol production by forming “microzones”
To link to this article: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.123141
Abstract:
Biochar is increasingly considered in addressing bioprocess issues due to its strong adsorbability and excellent compatibility to microbes. Here, biochar was first applied in aerobic solid-state fermentation (SSF) for erythritol production. Biochars derived from different agricultural wastes under various pyrolysis temperatures were evaluated, and wheat straw pyrolyzed at 300°C (WSc) performed the best in enhancing fermentative erythritol production, with a dosage of 4% (w/w). In this procedure, cell–biochar–substrate “microzones” were formed, which was conductive to cell growth and attachment, and hence contributed enhanced enzyme activities, oil consumption, and erythritol production. The resultant erythritol productions of batch and fed-batch fermentations were 207.3 and 222.5 mg/gds, respectively. In repeated-batch fermentation, high cell viability and robust erythritol synthesis were maintained throughout seven cycles. This study demonstrates that SSF can be remarkably facilitated by biochar addition, suggesting a new perspective of biochar application in microbiological processes.
Result:
Effects of biochar addition on SSF for erythritol production
本研究在 SSF中添加生物炭生产赤藓糖醇。将来自不同材料的生物炭添加到 PSW培养基中进行赤藓糖醇培养，结果如图所示，除 猪粪生物炭 外，所有添加生物炭培养基中的赤藓糖醇产量均高于对照。在添加麦秆生物炭中最大累积赤藓糖醇产量为 195.9 mg/gds，而不添加生物炭对照中的赤藓糖醇产量仅为 185.4 mg/gds。图 1中的结果还显示，添加生物炭的培养基中生物量增加到1.71-2.11 CFU/gds，对照仅为1.47 CFU/gds，在 WSc培养物中达到最大值。测定的 OC在各种培养中也有显着差异。开始时，生物炭培养基中的 OC0值显着高于非生物炭培养（10.2%）（范围从 12.5%到 20.4%）。当在 WSc培养基中测定最高 OC0 (20.4%)时。 OC在培养过程中下降，在培养72 h时达到最低值；然而，生物炭组的 OC72（超过 7.0%）也高于对照组（2.1%）。这些结果表明 OC的最高值被确定在 WSc培养基中，表明 WSc培养物中的氧气供应更高（10.7%）和更活跃的细胞活性。总体而言，生物炭培养物之间的差异是显而易见的。 WS（WSc）制备的生物炭最大程度地提高了赤藓糖醇的产量、生物量和氧气的供应和利用，而PM制备的生物炭效果最差。因此，有必要为某些 SSF选择最佳的生物炭。
Effects of pyrolysis temperature on biochar performance
生物炭的特性会随着热解温度的变化而改变，因为高温会降低生物炭中的碳含量和官能团。因此，在赤藓糖醇培养过程中，热解温度可能会影响生物炭的性能。将RH、DD、WS、MR和PM在不同的热解温度(300°C、500°C和700°C)下炭化，并将所得生物炭加入PSW培养基中，研究它们对各发酵体系赤藓糖醇产量的影响。在较高温度下制成的生物炭具有较大的表面积，温度升高导致表面积增大，700℃下制成的生物炭显示出最高的表面积，范围为314.0平方米/g至398.4平方米/g，比原始材料大15倍以上。这些结果表明，温度可以高度影响生物炭的表面积，并且是控制其吸附细胞和化合物的能力的最重要因素之一 。然而，在随后的赤藓糖醇生产过程中，赤藓糖醇的产量与生物炭的热解温度没有正相关，并且在不同的生物炭中，最佳热解温度在固体培养中有所不同。在300°C下获得了用于赤藓糖醇生产的最佳WSc，最高的赤藓糖醇产量为199.7 mg/gds，最大生物量为2.11 × 109 CFU/gds。相比之下，在较低或较高的热解温度下获得的WSc具有较少的赤藓糖醇和生物质产量。在其他生物炭 (例如RHc，DDc，MRc和PMc)中也观察到类似的趋势，并且它们用于生产赤藓糖醇的最佳热解温度分别为300 °C，500 °C，500 °C和300 °C。因此，在以下实验中，选择在300 °C下获得的WSc作为用于生产赤藓糖醇的最佳生物炭。
Changes of enzyme activities in WSc cultivation
在PSW培养基中添加生物炭可以提高赤藓糖醇的产量和细胞生长。 这些变化可能与负责底物水解和赤藓糖醇合成的关键酶的活性有关。在以前的研究中，解脂耶氏酵母的脂肪酶、蛋白酶、GK、TK和ER被认为是油脂-赤藓糖醇途径中的关键酶。因此，本研究测定了这些酶的活性，以探讨WSC对代谢通路的影响。在不添加生物炭培养中检测到较低的酶活性，WSC的存在酶活普遍提高，促进了大分子和刚性有机底物的水解，并产生了更多可供微生物吸收和利用的小分子有机底物。
由于油和蛋白质是油料作物废弃物中的主要成分，因此对参与降解原始培养基的关键酶（蛋白酶和脂肪酶）的活性进行了评估。在本研究中，WSc的存在导致脂肪酶和蛋白酶的活性增加，随后油和蛋白质的水解，从而改善了培养期间的碳和氮源供应。
油脂首先被脂肪酶催化生成甘油和脂肪酸，而GK主要负责随后的甘油同化。在糖异生途径之后，生成的葡萄糖-6-磷酸通过戊糖磷酸途径转化为核酮糖-5-磷酸（生产赤藓糖醇的重要前体）。TK催化果糖-6-磷酸酯和甘油醛-3-磷酸酯之间的反应，因此，高TK活性对于生产大量的中间体至关重要，这些中间体对于高赤藓糖醇的生产至关重要。ER催化4-磷酸红素转化为赤藓糖醇的最终反应，被认为是赤藓糖醇形成的限速酶转化为赤藓糖醇的最终反应，被认为是赤藓糖醇形成的限速酶。这些关键酶与赤藓糖醇的生产直接相关。在WSc培养基中，细胞和底物在相对集中的区域（“微区”）被吸收和积累，局部底物浓度的增加伴随着氧气供应的增加，改善了细胞的生长和活性。WSc培养基中GK、TK和ER活性的提高表明赤藓糖醇生物合成途径中甘油同化和碳流动增强。因此获得了较高的发酵强度和相当高的赤藓糖醇产量。
Optimal WSc addition level and cultivation trends of the WSc SSF
由于在 300 °C下热解的 WSc被确定为 SSF中生产赤藓糖醇的最佳生物炭，因此确定了 WSc添加量对赤藓糖醇生产的影响。 图 2a显示添加 2%到 4%的 WSc的培养物产生的赤藓糖醇高于对照（添加 0%）。提高了赤藓糖醇的产量，而更高的 WSc浓度（6%到 8%）导致了负面影响。 当在 PSW培养基中加入 4%的 WSc时，获得了最大的赤藓糖醇 (199.7 mg/gds)。 我们认为 WSc主要作为一种良好的微生物载体来提高赤藓糖醇的产量； 因此，通过添加 WSc也实现了改善的细胞生长（图 2a）。 添加 2%至 6%的 WSc将生物量从 1.85 × 109 CFU/gds增加到 2.35 × 109 CFU/gds，并且在添加 6%的 WSc时观察到最大累积生物量，与相比高出近 2
。具有 8% WSc的培养物显示生物量减少，甚至低于对照。 这可能是因为过量的生物炭添加稀释了培养基，从而导致细胞生长的底物供应减少。 细胞生长的最佳 WSc添加水平为 6%，而赤藓糖醇生产的最佳添加水平为 4%。 添加 6%的生物炭为细胞生长提供了最合适的环境，但由于可用底物减少，细胞过度生长反而对产物合成产生负面影响。 尽管添加 4% WSc可能不是最有利于细胞生长，但对生物质的轻微抑制有利于赤藓糖醇的合成。
细胞最初生长缓慢，24小时后进入指数阶段，然后细胞持续生长直到培养结束。油浓度在前24小时也缓慢降低，但在随后的24-72小时中观察到快速的石油消耗。在120-168小时，培养基中的石油几乎消耗殆尽。赤藓糖醇在细胞生长的指数阶段之前开始积累，在碳源耗尽144小时达到最大滴度199.7 mg/gds。
Comparison of different fermentation strategies for erythritol production on WSc-based medium
推断固体培养基中的细胞-生物炭-基质“微区”可能在最初的 24小时到 48小时内形成。细胞生长、底物利用率和赤藓糖醇产量都有很大提高；补料策略已广泛用于放大发酵以增强次生代谢物，在其进一步应用之前，寻找有效提高补料分批性能的合适途径一直是一个共同的研究课题。在含有 WSc培养基的批次 SSF中，培养开始时的滞后期导致发酵周期延长。因此进行分批 SSF以减轻这种滞后。培养过程中，当油浓度急剧下降时，在 72小时和 120小时加入两次补充 PSW培养基（100.0克）。观察到生物量略有波动，并且在培养过程中细胞浓度稳定增加，对应快速的油消耗。 144小时后培养基中耗尽的油最终导致细胞生长减弱。在流加培养过程中赤藓糖醇浓度不断增加，最高赤藓糖醇水平在216 h达到222.5 mg/gds。通过维持底物量水平来支持赤藓糖醇的过度积累。这些结果与之前的研究结果一致，其中分批补料策略可以减轻由高底物浓度引起的抑制作用，并使细胞活力更好地保持以获得高产率。
在批量SSF中，产物在培养基中的高积累会导致产物抑制的发生。重复批次策略可以克服这些缺点并节省清洁和接种时间。因此，它可以作为批量生产的替代品。在我们之前的研究中，在最后三个连续循环中，细胞活力和赤藓糖醇产量明显下降。在目前的工作中，进行了添加生物炭的重复分批培养，7个周期的重复分批SSF生产赤藓糖醇的结果如图3c所示。在第一批培养中，最大赤藓糖醇产量（207.3 mg/gds）在第 6天获得，生物质产量为 1.86 × 109 CFU/gds。第一次循环后更换培养基，培养基中残留的细胞可作为反应器的种子；因此，每个批次的滞后阶段都大大缩短了。由于营养补充充足，细胞生长更高效，生物量增加到超过 2.0 × 109 CFU/gds。赤藓糖醇浓度也明显增加（接近 220 mg/gds）。即使在最后一个周期，生物质和赤藓糖醇的产量也可能保持在相对较高的水平。原因可能在于培养基中的微区，可以减少来自培养环境的负面因素，从而有助于在培养过程中保持高细胞活力和旺盛的赤藓糖醇生产。
这些研究表明，SSF在大规模生物工业应用中具有适用性和生产赤藓糖醇的潜力，而生物炭的添加使SSF策略在进一步研究中更具竞争力。在未来的工业应用中，可以建立一个利用工农业废弃物的高效、低成本的发酵系统。
Conclusion：
The addition of WSc (produced from wheat straw under 300 °C) improved erythritol production in SSF. The other biochars did not show the same performance probably due to their lower content of functional groups. Cell–biochar–substrate “microzones” were formed in the biochar–PSW medium, which improved enzyme activities, substrate hydrolysis, and erythritol synthesis. WSc in PSW medium performed well in the scale-up, fed-batch, and repeated-batch SSFs. The good performance of biochar suggests its great potential in aerobic SSF for large-scale industrial erythritol production. A new perspective of biochar application was hence proposed.
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