实验室动态

利用农工废弃物生产茂原链霉菌转谷氨酰胺酶

发布时间：2021-11-14作者：梁佳文浏览量：10

利用农工废弃物生产茂原链霉菌转谷氨酰胺酶


Title : Utilization of agro-industrial waste for production of Transglutaminase from Streptomyces mobaraensis

Download website :

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.121391

Abstract :

This work studied the production of Transglutaminase (TGase) using wheat bran as carbon source. The medium components and culture conditions were optimized by statistical Box-Behnken response surface methodology. The release of active Transglutaminase was enhanced by adding (i) protease to remove pro-region to make inactive enzyme to active form, (ii) Cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) which facilitated more secretion. Under finally optimized conditions viz. 5 g wheat bran, protease: 39.14 U, magnesium chloride (MgCl2): 0.10 M, CTAB: 0.08% and inoculation size: 2% led to 4-fold (12.949 ± 0.061 IU/g) increased TGase production over that of un-optimized conditions. The application of TGase was shown to be useful in effective casein cross- linking.    

   


研究背景：

转谷氨酰胺酶（TGase）是一种重要的细胞交联酶，催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团作为酰基供体与不同的酰基受体发生酰胺基转移反应，导致蛋白质分子间及分子内交联、蛋白质与氨基酸之间连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应的发生，从而改变细胞蛋白质的性质。近年来，TGase已被开发用于在各种蛋白质中创建交联网络，以赋予稳定性和改变功能特性。这使得它在食品加工和生物医学研究中的应用非常广泛。

然而，TGase的稀缺来源和繁琐的下游处理导致了过高的价格，这限制了它更广泛的工业应用。在这种情况下，本研究试图使用固态发酵技术，利用廉价的农工业废弃物从茂原链霉菌中获得低成本、高滴度的TGase，利用茂原链霉菌产TGase是一种最广泛使用的TGase来源。

研究方法：

以农业废弃物为碳源固态发酵生产TGase：固态发酵（SSF）使用不同的农业废弃物作为底物，在500 ml 锥形瓶中进行TGase生产。通过改变氮源、水分含量、接种物大小、盐、蛋白酶和表面活性剂进行一次一因素（OFAT）优化。结果表明，蛋白酶、MgCl2、CTAB和接种量对TGase产量有重要影响。

采用符合Box-Behnken设计的响应面法优化生产TGase的培养条件：在上述过程中，添加菌液接种量（1-4 ml）、蛋白酶（丝氨酸蛋白酶10-40 IU）、MgCl2（0.05-0.15 M）和表面活性剂（0.02-0.08%），以木质纤维素农工业废弃物作为碳源，以蛋白胨、酵母抽提物、胰蛋白胨和豆粕为氮源进行了筛选。还研究了CaCO3、CaCl2、MgCl2和MgCO3、蛋白酶和表面活性剂（Triton X、CTAB、PEG和CHAPS）的影响。还检查了水分含量（w/v）的影响。采用Box-Behnken统计方法进行优化。观察了关键参数，即蛋白酶、MgCl2、CTAB和接种量。采用Design Expert®7.0.0软件进行实验设计和分析。基于三个中心点的设计矩阵，总共进行了27个实验，以最小化实验误差。基于响应值（TGase活性），生成模型，并通过方差分析（ANOVA）检验统计显著性。经过分析，预测的最大TGase产量的因素组合在实验上得到了进一步验证。



研究结果：

在OFAT中观察到了影响产量的重要因素，即蛋白酶，MgCl2，CTAB和接种量，使用符合Box-Behnken设计矩阵的RSM研究了它们的最佳组合。Box-Behnken设计也用于评估不同自变量之间的关系及其对TGase产生的交互影响。结果总结在表1中，并与多项式方程一起进行方差分析（表2）。根据编码变量和实际变量，二次响应方程的模型如下：

Transglutaminase = 8.20+0.25 *A+0.066 * B+0.52 *C−1.13 * D+0.39 * A * B+0.47 * A * C−0.18 * A * D – 0.67 * B *C−0.17 * B * D−0.16* C * D−0.94 *A2−2.72 * B2−0.13*C2+0.62 * D2.

方差分析表明TGase产量模型是可接受的，具有高度显著性（P≤0.05），预测的测定系数（pre R2 =99.19%）与调整后的测定系数（adj R2=99.66%）一致，准确度为86.397。根据两个实验因素绘制3D等高线图，将其他变量保持在中心水平不变，以评估独立因素的影响及其每个独立因素的交互影响，从而获得最佳TGase产量（图1）。所有这四个因素对TGase的产生都显示出积极的影响。

通过在假设的最佳条件下进行实验，验证了预期模型的有效性。该模型提出（i）蛋白酶-39.14（IU），（ii）MgCl2-0.10（M），（iii）CTAB− 0.08（%）和（iv）接种量− 2.02（ml）为最佳，预测TGase产率为10.469±0.10 IU/g。为了验证预测值，在优化条件下进行了实验，发现12.949±0.061 IU/g的TGase活性与预测的TGase活性非常一致。经过上述统计优化后，TGase产量比OFAT优化后的产量（3.318±0.047 IU/g）增加了4倍。TGase产量的增加非常显著。该研究强调了农业废物作为碳源的适宜性。

注：

响应面分析法，即响应曲面设计方法(Response Surface Methodology，RSM)，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。

BBD（Box-Behnken design）是响应曲面设计中的一种设计方法，有如下的特点：

  1. 可进行3~7个因素范围内试验；

  2. 试验次数一般为15~62次，在因素数相同时比CCD所需的试验次数少；

  3. 可评估因素的非线性影响；

  4. 适用于所有因素均为计量值试验；

  5. 使用时无需多次连续试验；

  6. Box-Behnken试验方案中没有将所有试验因素安排为最高水平的试验组合，对某些有特殊需要或安全要求的试验尤为适用；

  7. 具有近似旋转性，没有序贯性。




Contact: Li Haidong

E-mail: hadwinli@qq.com


友情链接